پایان نامه - مقاله - تحقیق

نفت خام کمپلکس ترکیبی است که بطور عمده از هیدروکربن های متغیر اشباع شده و اشباع نشده تشکیل شده است. بیوتکنولوژی نفت مجموعه ای از متد و روش ها برای تولید، تغییر و اصلاح فراورده ها و تولید میکروارگانیسم ها برای کاربردهای ویژه است. مثلا تحقیقات در زمینه ی MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) بمنظور افزایش برداشت از چاه های نفت به روش های میکروبی به منظور استخراج بیشتر نفت می باشد . میکروارگانیسم ها ابزار اصلی تحقیق در زمینه ی بیوتکنولوژی هستند که شامل باکتری ها، قارچ ها، جلبک ها ومیکروب هایی که در حوزه ی نفت در فرآیندهای پالایش-انتقال-تغییر و تبدیل مواد ،محیط زیست و خوردگی از ابزارهای اصلی بشمار می روند می باشند. که این منوط به حفظ و نگهداری میکروارگانیسم ها بدون کمترین تغییر ژنتیکی میباشد. در بخش مطالعات مخزن  در ایران برای اولین بار مطالعه ی مخزن آزادگان با یک شرکت نروژی  Sintef انجام شده روی سه میدان بزرگ نفت مارون، بی بی حکیمه و اهواز مشترک  با شرکت نروژی استات اویل مطالعه شده.  از 6/3 میلیون بشکه نفت 5/1 میلیون بشکه از این سه میدان تامین شده است. مطالعه جامع میدان (F.F.S )  و توسعه ی میدان ( M.D.D ) روی این زمینه فعالیت می کنند. مطالعه ی دیگر با شرکت روسی تاتنفت در زمینه ی ازدیاد برداشت به روش میکروبی میباشد که کار بزرگ و منحصر به فردی است.  در ایران 3 منطقه ی نفتی وجود دارد: زاگرس ، منطقه ی ایران مرکزی  و منطقه ی کپه داغ که ایران مرکزی در فارس و شمال بندر عباس  و کپه داغ در شرق گرگان و شمال شرق ایران قرار دارد. نفت خام ایران متشکل از مواد آلی است که قسمت اعظم آن کربن و هیدروژن همراه با مقادیر کم گوگرد ، ازت ، اکسیژن و

 

 مقادیر جزئی فلزات از جمله نیکل ، وانادیوم و…. میباشد. ( جدول 1-1 )

 

(جدول 1-1) نسبت ترکیبی نفت خام

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنصر	حداقل درصد وزنی	حداکثر درصد وزنی
کربن	2/82	1/87
هیدروژن	8/11	7 / 14
گوگرد	1/0	5/5
اکسیژن	1/0	5/4
نیتروژن	1/0	5/1

 

 جهت مقایسه ی انواع نفت خام نمی توان از آنالیز ترکیبات تشکیل دهنده ی آن استفاده کرد. بدین منظور از آزمایشات استانداردی استفاده میشود که تعیین کننده ی قیمت نفت خام خواهد بود ( 7 ).

کلمه ی نفت که در زبان انگلیسی Petroleum نامیده می شود از دو کلمه ی petra و oleum که در زبان یونانی به ترتیب به معنی سنگ روغن و یک نوع روغن می باشند تشکیل شده است . منابع انرژی در طبیعت شامل نفت، زغال سنگ، انرژی هسته ای، انرژی الکتریکی و غیره می باشد. با توجه به محدودیت منابع انرژی و اهمیت صرفه جویی در مصرف و آلودگی های زیستی ناشی از ان تحقیقاتی در زمینه ی علوم مختلف جهت مصرف بهینه و کاهش آلودگی های محیط زیست انجام شده است. به مجموعه تست هایی که شناسه ی نفت خام را مشخص میکنند crude assay گفته میشود. از جمله این خواص : اندازه گیری وزن مخصوص ، گوگرد ، نمک ، آب و مواد رسوبی ، گرانروی ، نقطه ی ریزش ، محدوده ی تقطیر ، ناخالصی های فلزی  و کربن باقی مانده میباشند. درجه ی API نفت خام در اکثر موارد بین10 تا 45 می باشد و به ندرت کمتر از 10 یا بالاتر از 50 میباشد.

نفت خام سنگین: با درجه API 10 الی 20

نفت خام متوسط: با درجه API 20 الی 30

نفت خام سبک: با درجه API بیش از 30

در یک دسته بندی کلی محصولات حاصل از نفت خام ایران شامل:

1-سوخت های گرمایشی

2-سوخت ماشین های درون سوز

3-حلال ها

4-روغن های روان ساز

5-مواد اولیه ی صنایع پتروشیمی و شیمیایی

6-آسفالت و قیر

نفت در دمای بالاتر از 200 درجه سانتی گراد حضور ندارد و هیدروکربن ها در این دما متلاشی می شوند. (شکسته میشوند) نفت ممکن است بوسیله ی تجزیه ی باکتریایی دگرسان شود . تجزیه ی باکتریایی سبب     سنگین تر شدن و گرانروی بیشتر نفت می شود. جریان آبهای زیرزمینی و فعالیت باکتریایی باعث تشکیل نفت سنگین میشود ( 1 و 2 ).

آب های شیرین زیستگاه طبیعی گونه های فراوانی ازآبزیان است که هر یک تا حدودی دارای فون وفلور مخصوص به خود می باشد. بنا به عقیده روزنبرگ(Rosenberg,1999)  مهمترین ذخایر آبزی آب های شیرین، بی مهره گان کفزی ساکن آنها می باشند که در شبکه ی غذایی و تولیدات رودخانه نقش اساسی دارند. همچنین برای تعیین کیفیت محیطی رودخانه ها و پایش بیولوژیکی آنها به کار می روند. در این راستا، موجودات شاخص و عکس العمل های آنها را نسبت به شرایط محیطی در نظر می گیرند. بطورکل محققین، اندازه گیری پارامترهای فیزیکی و شیمیایی  آب را به مانند برداشت عکس و بررسی بیولوژیکی (بخصوص ماکرو بنتوزها) را مشابه تهیه فیلم ویدیویی از یک اکوسیستم می دانند(Rosenberg,1999). در واقع تنها راه عملی و به صرفه اقتصادی برای تعیین سلامت اکولوژیکی آب ها و تعیین اینکه آیا فعالیتهای انسانی موجب کاهش کیفیت آنها می شود، ارزیابی و پایش بیولوژیکی است(Lenat,1993). ایده اصلی فرابینی زیستی بسیار ساده است زیرا انواع جانداران آب های شیرین در شرایط معین کیفیت آب قادر به حیاتند. زمانی که شرایط تغییر می کند؛ مثلاً وقتی که یک چشمه مقادیر قابل توجهی از آلودگی دریافت می نماید، فراوانی، توزیع و ترکیب جمعیت موجودات آبزی در منطقه مورد اثر تغییر میکند و بی مهره گان کفزی از رایج ترین ارگانیزم های بکار رفته در این مقوله اند.
تعداد شاخص۵ برابر تمام شاخص هایی است که در ارتباط با سایر گروهها  (جلبک ها وماهیان) وجود دارد. همچنین رینولدسون بیان می دارد که بی مهره گان کفزی، مؤثرترین گروه بوده و امروزه از اساسی ترین اجزای بیولوژی آب های شیرین هستند که به کمک آنها و با

 

 استفاده از ترکیب جمعیتشان و تکیه بر گروه های شاخص، شرایط کیفی آب ها مشخص می شود(Reynoldson,1992). در واقع  ماکروبتنوزها، موجوداتی هستند از جوامع جانوری که در داخل و یا روی بستر زندگی می کنند. بی مهره گان کفزی جانوری یا زئو بنتوزها ساکنان رایج در محیط های آبی بوده و حدأقل بخشی از چرخه زندگی خود را در بستر آبگیرها سپری می کنند. و بر روی الک های با منافذ ۵۰۰ میکرون (نیم میلیمتر) باقی می مانند(Rosenberg,1999). چندین ویژگی موجب شده که این موجودات بیشتر مورد توجه متخصصان پایش بوم سازه های آبی باشند.از جمله این ویژگی ها میتوان به این موارد اشاره نمود:

۱- آنها در همه آبگیرها حضور دارند.۲- تنوع گونه ای بالایی دارند  و با تعداد زیاد گونه ها اغلب دارای محدوده وسیعی از حساسیت نسبت به آلاینده ها بوده که پاسخهای وسیعی به تغییر شرایط مهیا می نمایند.۳- ساکن بستر بوده، جابجایی و حرکت مشخص ندارند.۴- چرخه زندگی طولانی داشته به طوری که امکان بررسی وتعیین حدود و وسعت مکانی و زمانی آشفتگی ها را فراهم می آورند.۵- تغییرات کیفی آب را برخلاف اندازه گیری پارامترهای فیزیکی وشیمیایی، بصورت دوره ای نمایش می دهند(Feminella,1999). اینها همه از مزایایی هستند که برای مطالعات ارزیابی  زیستی به بی مهره گان کفزی نسبت به سایر گروهها (جلبک ها و ماهیان) اولویت می بخشد. استفاده از بی مهره گان کفزی  بر این فرض استوار است که آب هایی که در فشار آلودگی هستند تنوع کمتری داشته و در آنها گونه های مقاوم غالبیت داشته باشند(Wallen,2002). با توجه به بحران کم آبی و خشکسالی های متعدد منابع آب های سطحی در کشور ایران، اهمیت این منابع به ویژه چشمه های باداب سورت ،از اهمیت بسیار زیادی برخورداراست.

با این حال در حقیقت در کشور ما تاکنون بررسی هایی که در ارتباط با آب های شیرین به انجام رسیده است معمولا بدون پیوستگی خاص و هدف مدون پیگیری شده است، اینگونه بررسی ها غالبا درحد بررسی های کلی و نیز ثبت شرایط فیزیکی وشیمیایی و تا حدودی فون آنها بوده است. بررسی هایی که در برگیرنده شناخت اکولوژیکی و تنوع زیستی آب های جاری بوده و با هدف ارزیابی کیفی آب های جاری از جنبه اکولوژیکی و بیولوژیکی باشد، اندک بوده ویا موجود نیست. جا دارد تحقیقات وسیع تردرآب های داخلی  انجام شود و منابع آبی تحت پایش بیولوژیکی دایم باشد.

درحقیقت آنها با اشرافی که به اهمیت منابع آب های جاری خود دارند، تحت برنامه های مدون و منظم به پایش منابع آب های سطحی خود پرداخته و لذا در مطالعات خود بهترین ابزار را که همانا پایش بیولوژیکی و استفاده از ماکرو بنتوزها بعنوان موثرترین نشانگرهای محیطی می باشند، بکاربسته اند. بعنوان مثال فقط در ایالات متحده چندین آژانس و سازمان دولتی و غیر دولتی مانند آژانس حفاظت محیط زیست(EPA)، موسسه حفاظت منابع طبیعی (NRCC)و… با بکارگیری بیولوژیست ها به پایش زیستی منابع آبی می پردازند. در هر صورت از بین مقالات ومطالعات بسیاری که اساساً فون ماکروبنتوز رودخانه ها را مورد توجه قرار داده اند می توان به چندین مورد اشاره نمود : تحقیق در مورد پراکنش گونه ای از سخت پوستان کفزی بنام صدف گورخری  Dreissena Polymorpha در سال١٩٩١ توسط Strayer  در نهرهای آمریکای شمالی بصورت طولانی مدت انجام شده در این پژوهش ، پارامترهای فیزیکی و شیمیایی آب و تراکم نمونه ها به همراه شرایط فیزیکی ایستگاه  مورد بررسی قرار داده ، که پراکنش و غنای گونه مزبور به همراه اثرات فصول و ایستگاه های نمونه برداری در نهرهای مختلف مورد تجزیه و تحلیل نهایی قرار گرفته و در رابطه با شرایط کیفی نهرها اظهار نظر نموده است(Strayer,1991).

همچنین درمطالعه ای مشابه، تر کیب گونه ای بی مهره گان کفزی وشرایط محیطی در نهر کوکامبر توسط Bass درسال١٩٩٥، مورد مطالعه واقع شده  بدین صورت که نمونه های آب و بی مهره گان کفزی از ایستگاه های بالادست وپایین دست نهر مزبور بطور فصلی جمع آوری شده و با توجه به عوامل محیطی و ساختار جمعیتی بی مهره گان بخصوص شاخص تنوع، نهر مزبور را مورد  ارزیابی کیفی قرار داده و در نتیجه این نهر را محیطی مناسب که قابلیت حمایت از گروه های متنوعی از کفزیان دارد تشخیص داده است(Bass,1995) .در راستای تحقیقات مذکور به عنوان اهداف این پروژه سعی شده است که جوامع کفزی رودخانه مورد شناسایی واقع شوند همچنین، فراوانی وپراکنش فصلی ماکروبنتوزهای رودخانه تعیین گردد علاوه بر آن ساختار جمعیت ماکروبنتوزهای ساکن رودخانه در طول مسیر(محل ایستگاه ها) مورد ارزیابی واقع گردد که در نهایت بتوان ارزیابی دقیق، سریع و در عین حال ارزان قیمتی از رودخانه ارایه نماییم. همچنین رودخانه از دیدگاه شاخص زیستی، طبقه بندی اکولوژیکی گردد و تاحدودی منابع عمده آلوده کننده رودخانه شناسایی شود.

علم شیمی تجزیه روش­های متنوعی را برای آنالیز کمی و کیفی مواد ارائه می­دهد. امروزه روش­های جداسازی، تفکیک گونه­ای موجود در بافت‌های پیچیده را با حد تشخیصی در حد خیلی کم (فمتوگرم) مقدور ساخته است. علاوه بر روش­های جداسازی، مرحله­ی آماده‌سازی نمونه نیز یکی از مهمترین مراحل در روند تجزیه می­باشد. این مرحله شامل تبدیل بافت یک نمونۀ حقیقی به حالتی است که برای تجزیه با

 

 یک تکنیک جداسازی و یا روش­های دیگر مناسب باشد. می­توان گفت مرحله­ی آماده‌سازی نمونه برای اهداف زیر طراحی شده است:

1- حذف مزاحمت‌ها از نمونه به منظور افزایش گزینش‌پذیری روش

2- پیش تغلیظ آنالیت مورد نظر و افزایش غلظت آن به نحوی که بتوان آنرا با دستگاه‌های تجزیه­ای اندازه‌گیری کرد.

3- تبدیل آنالیت­ها به فرمی که برای شناسایی با دستگاه تجزیه­ای مناسب باشد.

اساسی‌ترین روش آماده‌سازی نمونه، روش استخراج است. تلاش متخصصین شیمیتجزیه برای ابداع و توسعه­ی روش­های اندازه­گیری با دقت و صحت بالا و نیز حذف مراحل دستی که موجب تکرارپذیری پایین در روش­های تجزیه­ای می­شود، باعث شده که روش­های استخراجی نوینی ابداع گردد. شکل (الف)روش­های مختلف استخراج و میکرواستخراج را دسته­بندی می­کند که راجع به آنها توضیحات مفصلی در مراجع آمده است.

در فصل دوم نیزبه اختصار راجع به میکرواستخراج مایع- مایع با قطره روش­های استخراج برپایه استفاده از فیبرهای توخالی متخلخل بحث خواهد شد.

شکل (الف). روش‌های مختلف استخراج و میکرو استخراج

فصل اول

 

كلیات

 

1-1. بیان مسأله

جهت اندازه‌گیری مقادیر بسیار اندک دونپزیل در مایعات بیولوژیک، می‌بایست از متودی استفاده شود که به تیم پزشکی در تنظیم دوز دارو بدون نیاز به خونگیریو از طریق غیر تهاجمی کمک کند و قدرت شناسایی و تفکیک این دارو را داشته باشد.با استفاده از متود پیش تغلیظ دارو با میکرواستخراج فاز مایع به کمک هالوفایبر می‌توان مقادیر بسیار کم این دارو را در ادرار تغلیظ و استخراج نمود، سپس با دستگاه HPLC اندازه‌گیری کرد.این روش بسیار جدید بوده و تا به حال جهت پیش تغلیظ و اندازه‌گیری این دارو استفاده نشده است.

:

اصول كلی سازمان تجارت جهانی ناظر بر اجرای آن است كه در مواد مختلف گات و سازمان تجارت جهانی آمده است، یكی از این اصول اصل پایه گذاری تجارت منصفانه است. شاید بتوان اصول مذكور را ضمانتی برای كارآمدی و نتیجه بخش بودن اقدامات صورت گرفته بر اساس سایر اصول دانست. رویه هایی مختلف تجارت بر اساس عدم تبعیض میان اعضا می باشد و نتیجه آن عدم اختلال در بازار و عدم آسیب به منافع شركای مختلف است. رویه های تجاری غیر منصفانه به نحو غیر قابل توجهی افزایش یافته است كه این رویه ها ممكن است با دخالت دولت شكل گیرد كه در این صورت علل خصوصی در مورد یارانه صادرات به خودی خود تبعیض را در مورد كالاهای وارداتی به دنبال خواهد داشت.

تبعیض بطور اساسی به معنای فروش یك كالا در بازار خارجی با قیمت كمتر از هزینه های نهایی تولید آن كالا در كشور عرضه كننده به منظور كسب مزیت در رقابت با دیگر اعضا در خصوص همان كالا است. موافقتنامة سازمان جهانی تجارت قضاوتی را در این خصوص ارائه نمی كند بلكه تمركز خود را بر این نكته می گذارد كه دولتها چگونه در مقابل تبعیض گرایی عكس العمل نشان می دهند و اقدامات مقابله ای با آن را چگونه تنظیم می كنند. موافقتنامة عهدی تعرفه و تجارت بطور كلی اصول را مطرح می كند كه بر مبنای آنها آزاد سازی تجارت

 

 خارجی و دسترسی آسان تر به بازارهای خارجی میسر می گردد و این مهم از طریق لغو موانع غیر تعرفه ای و جایگزینی نظام تعرفه ها در بازرگانی بین المللی بدست می آید. با این وجود همواره احتمال بروز خسارت از ناحیه تجارت خارجی برای برخی كشور ها وجود دارد كه یكی از علل عمدة آن می تواند مبادرت ورزیدن به دامپینگ از سوی یك شركت یا كشور در بازار وارد كننده محصولی خاص باشد. ماده 7 قانون امور گمركی نیز مقرر می دارد هرگاه كالایی با قیمت نامناسب یا تسهیلات غیر عادی از كشوری برای ورود به ایران عرضه شود و این عمل برای اقتصاد كشور، رقابت ناسالم تلقی گردد هیات وزیران می تواند در هر موقع بنا به پیشنهادات وزارت اقتصاد برای ورود كالاهای مذبور از آن كشور سود بازرگانی ویژه ای برقرار كند.

تولید كنندگان بیشتر به دلایل رقابتی از جهات اقتصادی دست به رفتار تبعیض آمیز و دامپینگ می زنند و دخالت های دولت در این مورد بیشتر در جهت بهبودی در تراز پرداخت های خارجی خود و یا سایر دلایل سیاسی صورت می پذیرد.

با توجه به مطالب فوق و همچنین بابحث آزاد سازی تجارت جهانی و گسترش فضای رقابتی در سطح بین الملل اهمیت ضرورت رسیدگی و بررسی تبعیض میان اعضا و كالاها و مقررات در خصوص دامپینگ آشكار می گردد، در این مقاله سعی شده است تا راهكارها و روش های موجود برای جلوگیری از تبعیض و رعایت مقررات و چگونگی ایجاد بستری مناسب برای آزاد سازی و رقابت سالم مطرح شود و اصل عدم تبعیض در سازمان تجارت و تجارت ایران در سطح بین الملل مورد برسی قرار گیرد.

الف- بیان مسئله:

اصل عدم تبعیض یکی از اصولی است که از آن بعنوان سنگ بنای سیاست در تجارت یاد میشود.این اصل را میتوان در بسیاری از موارد که منجر به برهم زدن روابط تجاری در سطح بین المللی میشود­، مورد استناد قرار داد تا از سو استفاده های موجود در تجارت کالا جلوگیری نماید. اصل عدم تبعیض در تجارت کالا و خدمات نیز میتواند منجر به شکوفایی در نظام تجارت بین الملل گردد و از فریب کاری و ایجاد یک بازار رقابتی نا سالم جلوگیری کند. با توجه به مطالب  نیاز به یك پژوهش در زمینه برسی عدم تبعیض در تجارت کالا احساس می شود  تا اینکه با انجام این پژوهش بتوان پیشنهاد های خوبی را برای هر چه بهتر شدن روابط تجاری در سطح بین المللی ­ارائه گردد. ­در این تحقیق سعی بر این است تبعیضات موجود­ در تجارت کالا و خدمات و چگونگی جلوگیری از آن را بحث کنیم.

ب- اهداف تحقیق:

– تبیین و شفاف سازی علل و موارد مورد اختلاف و برسی آثار مورد اختلاف در روابط فی مابین کشورها از لحاظ حقوقی.

– ارائه راهکارهای مناسب با توجه به برسی تحقیقات مربوط به موضوع و ارائه راهکارهای جدید.

– علل اینکه قوانین ایران و سازمان تجارت جهانی نتوانسه موارد مورد اختلاف کشورها را در زمینه تجارت بطور کامل پوشش دهد.

 

ج- پیشینه تحقیق:

در مورد مطالعاتی که صورت گرفته است این موضوع به دلیل اهمیت بحث تجارت جهانی و ایجاد یک بستر تجاری مناسب در روابط تجاری کشورها در موارد گوناگون مورد برسی قرار گرفته است و در مواردی هم که کار شده است نتایج حاصل از آن در جهت پیشبرد اهداف و ارائه راهکار­های مناسب مورد استفاده قرار گرفته است.

د- سوال های تحقیق

• در صورت وجود اختلاف و تبعیض در روابط تجاری کشورهای عضو و غیر عضو سازمان تجارت جهانی چه راهکاری وجود خواهد داشت؟
• در صورت وجود اختلاف و تبعیض در قوانین و مقررات سازمان تجارت جهانی و ایران حکم چیست؟
• چگونه میتوان مانع از اعمال رفتار نا برابر تجاری، مانند فریب کاری، ایجاد تبعیض و..در روابط تجاری میان کشور ها جلوگیری کرد؟

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

 

گرایش :میکروبیولوژی

 

عنوان : طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از  واكسن سیاه سرفه

 

دانشگاه آزاد اسلامی

 

واحد علوم دارویی

 

دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه زیست شناسی

 

 

 

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M.Sc))

 

گرایش: میکروبیولوژی

 

 

 

عنوان:

 

طراحی و استقرار روش جدید سم زدایی سریع از  واكسن سیاه سرفه

 

 

 

استاد راهنما:

 

جناب آقای دکتر عبدالرضا موحدی

 

 

 

اساتید مشاور:

 

جناب آقای دکتر اسماعیل اصلی

 

جناب آقای دكتر حسین عطار

 

 

 

سال تحصیلی 92-1391

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                              صفحه

خلاصه فارسی ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 1

فصل اول: کلیات

1-1. بیان مسئله ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-2. تاریخچه بیماری سیاه سرفه …………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-3. باکتریولوژی…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 7

1-4. ترکیبات مهم باکتری سیاه سرفه …………………………………………………………………………………………………. 10

1-4-1. توکسین پرتوسیس…………………………………………………………………………………………………………………….. 10

1-4-2. فیلامنتوس هموگلوتینین (FHA)………………………………………………………………………………………….. 12

1-4-3. فیمبریه و آگلوتینین ها…………………………………………………………………………………………………………….. 13

1-4-4. پرتکتین………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

1-4-5. آدنیلات سیکلاز (ACT)…………………………………………………………………………………………………………. 16

1-4-6. تراکئال سایتو توکسین (TCT)………………………………………………………………………………………………. 17

1-4-7. توکسین حساس به حرارت……………………………………………………………………………………………………….. 18

1-4-8. BrKA………………………………………………………………………………………………………………………………………. 18

1-4-9. اندوتوکسین………………………………………………………………………………………………………………………………… 19

1-5. سویه های بوردتلا پرتوسیس ………………………………………………………………………………………………………… 19

1-6. اپیدمیولوژی ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-6-1. وضعیت بیماری در ایران……………………………………………………………………………………………………………. 21

1-7. بیماری زایی سیاه سرفه  ………………………………………………………………………………………………………………. 21

1-8. علائم کلینیکی ………………………………………………………………………………………………………………………………. 22

1-9. تشخیص بیماری …………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-1. تشخیص بالینی………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان…………………………………………………………………………………………………………. 24

1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان………………………………………………………………………………………………….. 25

1-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه ………………………………………………………………………………………………… 26

1-10-1. پاسخ ایمنی همورال………………………………………………………………………………………………………………… 27

1-10-2. پاسخ ایمنی سلولی…………………………………………………………………………………………………………………. 28

1-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-1. کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-2. سرولوژی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 30

1-11-3. PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 32

1-12. مدیریت بیماری…………………………………………………………………………………………………………………………….. 33

1-13. پیشگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

1-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی……………………………………………. 35

1-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان……………………………………………………………………………………… 37

1-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین………………………………………….. 37

1-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان…………………………………………………………………………………………… 38

1-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری……………………………………………………………………………….. 38

1-14. استراتژی های واکسن………………………………………………………………………………………………………………….. 39

1-14-1. واکسن غیر سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………. 39

1-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………. 40

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………………. 42

2-1-1. تعریف تست كنترل سمیت زدایی (MWGT) ……………………………………………………………………. 43

2-1-2. تعریف تست حفاظتی داخل مغزی موش (تست توانمندی Potency test) …………………… 44

2-1-3. ابداع روش کشت……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

2-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت……………………………………………………………………………………………… 45

2-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی…………………………………………………………………….. 46

2-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 47

2-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه…………. 47

2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………. 49

2-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………………….. 49

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1. تجهیزات و وسایل ………………………………………………………………………………………………………………………….. 51

3-2. مواد و محیط ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 52

3-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو……………………………………………………………………………………………………. 52

3-2-2. محیط کشت وِروِی…………………………………………………………………………………………………………………….. 53

3-2-3. محیط B2…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-4. محیط کشت سویابین کازئین…………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-5. محیط تیوگلیکولات براث………………………………………………………………………………………………………….. 55

3-3. روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 56

3-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس……………………………………………………………………………………….. 56

3-3-1-1. لیوفیلیزه کردن……………………………………………………………………………………………………………………… 56

3-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………….. 56

3-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………. 56

3-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِی………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 57

3-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور…………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوری……………………………………………………… 58

3-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور…………………………………………………………………………… 58

3-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت…………………………………………………………………………. 59

3-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سانتریفوژ…………………………………………………………………. 59

3-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سیستم میکرو فیلتراسیون……………………………………. 59

3-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………… 60

3-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………. 60

3-3-5-1. سمیت زدایی با استفاده از فرمالین……………………………………………………………………………………… 61

3-3-5-2. سمیت زدایی با استفاده از تیومرسال………………………………………………………………………………….. 61

3-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه…………………………………………………………………………… 61

3-3-6-1. تست استریلیتی……………………………………………………………………………………………………………………. 61

3-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باكتری…………………………………………………………………………………….. 62

3-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) …………………………………………………………………………… 62

3-3-6-4. تست توانمندی……………………………………………………………………………………………………………………… 62

فصل چهارم: نتایج

4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………… 64

4-2. تهیه بذر در محیط وِروِی……………………………………………………………………………………………………………….. 64

4-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………………………………… 64

4-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت………………………………………………………………………………………….. 67

4-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………… 69

4-5-1. سمیت زدایی با فرمالین…………………………………………………………………………………………………………….. 69

4-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………. 69

4-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه……………………………………………………………………. 69

4-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه

سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال…………………………………………………………………………………………….. 72

4-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها……………………………………………………………………….. 75

4-9. تست توانمندی واکسن های آزمایشی سیاه سرفه……………………………………………………………………….. 80

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 83

نتیجه گیری و پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………. 88

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 89

خلاصه انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 97

ضمایم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 98

 فهرست جداول

عنوان                                                                                                                             صفحه

جدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………… 9

 

 

جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه……………………………………………………………………………………… 26

جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن……………….. 34

جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف…………………………………………………………………. 36

جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B2  بر اساس گرم در لیتر…………………………………………………………….. 45

جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده………………………………………………………………………… 51

جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه………………………………. 52

جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………………………….. 53

جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی………………………………………………………………………………………………… 53

جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B2…………………………………………………………………………………………………… 54

جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین………………………………………………………………………………. 55

جدول4-1. اطلاعات دوره كشت باكتری سیاه سرفه برای تولید واكسن…………………………………………….. 68

جدول4-2. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با فرمالین……………………………………………………………………………………………………………………………….. 70

جدول4-3. نتایج حاصل از انجام آزمایش های غیرفعال سازی و استریلیتی سوسپانسیون های باكتری  سیاه سرفه سمیت  زدایی شده با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با استفاده از آزمون MWG………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

جدول4-5. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با استفاده از آزمون MWG   76

جدول4-6. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با استفاده از آزمون MWG 77

جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV)     80

جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندی برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV)  81

 فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                صفحه

 

نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال

2000 تا 2010 ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6

نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-3. مقایسه­ی میانگین جذب نوری در طول موج های530 و590 در مقدار جرم  باكتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه 134 و 509……………………………………………………………………………………………………………… 66

نمودار4-4. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 134 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت   66

نمودار4-5. مقدار غلظت نهایی باكتری سیاه سرفه (cell109×1) سویه 509 در پایان دوره كشت در هنگام برداشت   67

نمودار4-6. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه  سویه 134  توسط  فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست MWG ……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-7. مقایسه دوره ی سمیت زدایی سوسپانسیون های سلولی  سیاه سرفه در سویه 509 توسط فرمالین و تیومرسال با استفاده از تست  MWG……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-8. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین نسبت به تیومرسال در سویه 134……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-9. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با واكسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین

نسبت به تیومرسال در سویه  509………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-10. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده با سوسپانسیون های سمیت زدایی شده سویه 134 با تیومرسال و فرمالین نسبت به موش های گروه كنترل……………………………………………………………………………………………….. 79

نمودار4-11. مقایسه اختلاف وزن موش های تزریق شده توسط واكسن سیاه سرفه حاصل از سمیت­

زدایی با فرمالین وتیومرسال در سمیت زدایی درسوش509 توسط تست MWG ……………………….. 79

نمودار4-12. مقایسه نتایج حاصل از توانمندی واكسن های تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV) با واكسن های تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال((TDV …………………………………………………………………………………… 81

       فهرست اشكال

عنوان                                                                                                                               صفحه

شكل1-1. كوكوباسیل سیاه سرفه……………………………………………………………………………………………………………… 7

شكل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسیس به سلول های پوشش مژه دار مجاری تنفسی……………………………….. 9

شكل1-3. شمای شماتیك از پرتوسیس توكسین…………………………………………………………………………………. 11

شكل3-1. فرمانتور استفاده شده برای كشت سیاه سرفه……………………………………………………………………… 58

خلاصه فارسی

سیاه سرفه بیماری عفونی باكتریال دستگاه تنفس است كه عامل آن بوردتلا پرتوسیس از دسته باكتری های گرم منفی می باشد.  در این مطالعه شش بچ از سویه های 134 و 509 باكتری سیاه سرفه تهیه شده و مورد مقایسه قرار گرفتند. از دو روش فیزیكی سانتریفوژ و میكروفیلتراسیون برای جداسازی سلول باكتری از محیط كشت استفاده گردید. سپس سلول­های جداسازی شده باكتری درPBS  خنك و استریل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نام­های سوسپانسیون سمیت­زدایی با فرمالین (FD) و سوسپانسیون سمیت زدایی با تیومرسال (TD) تقسیم شدند. به سوسپانسیون هایFD  بعد از غیرفعال سازی در حرارت 56 درجه سانتیگراد بمدت 10 دقیقهmM  10فرمالین (7/37 %) اضافه گردید و به سوسپانسیون هایTD  در شرایط مشابه، بعد از غیرفعال سازی با حرارت، w/v 01/0 % تیومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسیون در دمای 8-4 درجه سانتیگراد برای سمیت زدایی انكوبه شدند. در روزهای 10، 30، 90، 180 و 270 از هر دو نوع سوسپانسیون نمونه برداری شد تا سمیت آنها با انجام تست افزایش وزن موش (MWG) مورد ارزیابی قرار گیرد. در نهایت نیز شش واكسن آزمایشی FD وTD  از مخلوط كردن غلظت های مشابه دو سویه 134 و 509 تهیه گردید تا بتوان توانمندی این واكسن ها را در تست حفاظتی موش با تستKendrick  ارزیابی نمود. نتایج حاكی از آن بود كه روش سمیت زدایی با فرمالین با میانگین دوره  6/26 روز در مقایسه با روش سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین دوره 195 روز، روش كوتاهتری از نظر زمانی برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه است. توانمندی واكسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با فرمالین با میانگین 9/5 از واكسن تجربی حاصل از سمیت زدایی با تیومرسال با میانگین 95/5 قدری كاهش را نشان داده است. براساس نتایج حاصل، فرمالین با كاهش دوره سمیت زدایی در درجه حرارت 8-4 درجه سانتیگراد بمیزان 5/7 برابر بسیار مناسب تر از تیومرسال بود. اگرچه توانمندی واكسن حاصل از روش سمیت زدایی با تیومرسال حدود 05/0 واحد بیشتر از واكسن حاصل از سمیت زدایی با فرمالین است ولی تفاوت از نظر آماری ناچیز بود.

کلیدواژه­ها: بوردتلاپرتوسیس- سمیت زدایی- تیومرسال- فرمالین- تست افزایش وزن موش (MWG) – تست حفاظتی موش با تست kendrik

فصل اول

 

کلیات

 

1-1. بیان مسأله

بیماری سیاه سرفه یك عفونت تنفسی بوده كه توسط باكتری بوردتلا پرتوسیس[1] از دسته باكتری­های گرم منفی ایجاد می شود. نشانه عمده بیماری سرفه هایی است كه ممكن است تا چند هفته نیز طول بكشد كه مشخصه آن پاروكسیزمال[2] شدید با سرفه های ناگهانی است كه اغلب خاتمه آن با یك دم همراه می باشد. بیماری در نوزادان و اطفال بیشتر رخ می دهد (2و18).

در تولید واکسن سلولی سیاه سرفه به روش سنتی و جاری آن در مؤسسه واكسن و سرم سازی رازی جدا سازی باكتری به روش ترسیب با اسیدكلریدریك انجام گرفته و سپس به منظور سمیت زدایی[3] توکسین های موجود در سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه از تیومرسال و انکوباسیون درسردخانه به مدت طولانی 12-9 ماه استفاده می گردد. جدا سازی جرم باكتری با استفاده از اسید از یك سو و فرآیند طولانی     سمیت زدایی با مرتیولات از سوی دیگر منجر به کاهش توانمندی واکسن می گردد. لذا در این پروژه با جایگزینی روش های جدا سازی فیزیكی باكتری از محیط كشت بجای روش شیمیایی از یك سو آسیب­های احتمالی به ساختار سلولی باكتری را كاهش داده و از سوی دیگر با استفاده از فرمالین بجای تیومرسال زمان مورد نیاز برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه به حداقل تقلیل یافت تا ضمن کاهش دوره فرآوری   آنتی ژن بتوان فرآورده ای با کیفیت مناسب تر را تولید نمود (4).