متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

 

گرایش :علوم سلولی و مولکولی

 

عنوان : آنالیز مولکولی ژن  مولد کپسول PRP در نمونه های هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b جدا شده از نمونه های بالینی به منظور انتخاب بهترین سویه واکسینال بومی

 

دانشگاه آزاد اسلامی

 

واحد علوم دارویی

 

دانشکده علوم و فناوری های نوین، گروه زیست شناسی

 

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد((M.Sc))

 

گرایش: علوم سلولی و مولکولی

 

عنوان:

 

آنالیز مولکولی ژن  مولد کپسول PRP در نمونه های هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b جدا شده از نمونه های بالینی به منظور انتخاب بهترین سویه واکسینال بومی

 

استاد راهنما:

 

سرکار خانم دکتر ناهید مژگانی

 

استاد مشاور:

 

جناب آقای دکتر محمدحسین بناءبازی

 

 

 

سال تحصیلی: 93-1392

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

عنوان                    فهرست مطالب                صفحه

فصل اول: کلیات

خلاصه فارسی.. 1

فصل اول: کلیات

1-1: تاریخچه. 3

1-2: خصوصیات عمومی جنس هموفیلوس: 4

1-3: نیازهای غذایی.. 6

1-4: دسته بندی و تیپ بندی هموفیلوس آنفلونزا 8

1-4-1: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا: 8

1-4-2: سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا: 9

1-4-3: دیگر سیستم های دسته بندی: 9

1-5: خصوصیات پاتوژنیک… 9

1-5-1: آنتی ژن کپسولی.. 9

1-5-2: فاکتورهای ویرولانس و آنتی ژن های دیگر: 11

1-5-3: عوامل تشکیل کلنی و ویرولانس…. 12

1-6: علائم کلینیکی عفونتهای هوفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 13

1-6-1: مننژیت… 15

1-7:درمان: 15

1-7-1: واکسن های موثر و مقایسه آنها 15

1-8: تشخیص: 18

1-8-1: روش کشت… 18

1-8-2: روش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT). 19

1-8-3: روش مولکولی.. 19

1-9: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 19

1-9-1: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی.. 21

1-9-1-1: منطقه I. 22

1-9-1-3: منطقه II. 22

1-9-1-2: منطقه III. 22

1-9-1-4: قطعه IS1016 23

1-9-1-5: تعداد کپی جایگاه cap. 24

1-9-1-6: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 25

1-9-1-7: ژنوتیپ های Hib.. 27

1-10: روش های تعیین تعداد کپی جایگاه cap در ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 28

1-11: Real-time PCR.. 28

1-11-1: تعریف و مفهوم : 28

1-11-2: مزایای روش Real-time PCR: 29

1-11-3: انواع روش های Real-time PCR: 29

1-11-4: روش های تعیین کمیت با Real-time PCR: 32

1-11-4-1: Absolute Quantification : 32

1-11-4-2: چگونگی رسم یک منحنی استاندارد: 32

1-11-4-3: Relative Quantification.. 33

1-11-5: کاربرد های Real-time PCR: 34

1-12: بیان مساله. 34

1-13: ضرورت انجام تحقیق.. 35

1-14: اهداف پژوهش…. 36

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1: مطالعات انجام شده در ایران. 38

2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ایران. 39

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1: محیط های کشت… 43

3-1-1: محیط کشت شکلات آگار. 43

3-1-1-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 43

3-1-1-2: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 43

3-1-2: محیط کشت آگار خون دار. 44

3-1-2-1: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 44

3-1-3: محیط کشت BHI+ supplement مایع.. 44

3-1-3-1: مواد و دستگاه های مورد نیاز. 44

3-1-3-2: روش تهیه 500 میلی لیتر محیط کشت  BHI+ supplemenمایع.. 44

3-2: کشت نمونه ها 45

3-3: فریز کردن باکتری.. 45

3-3-1: مواد و تجهیزات لازم. 45

3-3-2: روش فریز کردن. 45

3-4: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا 46

3-4-1: تست نیاز های غذایی.. 46

3-4-2: رنگ آمیزی گرم. 46

3-4-2-1: مواد و تجهیزات لازم. 46

3-4-2-2: روش رنگ آمیزی گرم. 46

3-5: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR). 47

3-5-1: استخراج DNA  از باکتری به روش جوشاندن. 47

3-5-1-1: مواد و تجهیزات لازم. 47

3-5-1-2: روش استخراج.. 48

3-5-2: پرایمرها 48

3-5-2-1: آماده سازی پرایمرها 49

3-5-3: برنامه PCR.. 49

3-5-4: تهیه مستر میکس PCR.. 50

3-5-4-1: مواد و تجهیزات لازم. 50

3-5-4-2: روش تهیه مسترمیکس…. 50

3-5-5: تهیه 500 میلی لیتر بافر TAE 10X.. 53

3-5-5-1: مواد و تجهیزات لازم. 53

3-5-5-2: روش تهیه بافر. 53

3-5-6: الکتروفورز محصول PCR.. 53

3-5-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 53

3-5-6-2: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز. 53

3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR.. 54

3-6: استخراج PRP. 54

3-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 54

3-6-2: تهیه  ml50 محلول CTAB 0.5 M… 54

3-6-3: تهیه ml 50  محلول NaCl 0.4 M… 55

3-6-4: روش استخراج PRP. 55

3-7: اندازه گیری PRP به روش بیال. 56

3-7-1: مواد و تجهیزات لازم. 56

3-7-2: روش اندازه گیری PRP. 56

3-8:تعیین تعداد کپی cap با استفاده از Real-time PCR: 57

3-8-1: مواد و تجهیزات لازم: 57

3-8-2: شرایط واکنش: 57

3-8-3: کمیت سنجی مطلق(Absolute quantification): 59

3-8-3-1: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد. 59

3-8-3-2: تهیه منحنی استاندارد. 60

3-8-4: کمیت سنجی نسبی (Relative Quantification): 62

3-9: تعیین ژنوتیپ نمونه ها با استفاده از PCR : 62

فصل چهارم: نتایج

4-1: نتایج روش های تشخیص عمومی.. 65

4-1-1: نتایج نیاز غذایی.. 65

4-1-2: نتایج رنگ آمیزی گرم. 65

4-2: نتایج آزمون PCR.. 66

4-2-1: تایید هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار بودن نمونه ها 66

4-2-2: تایید تیپ b بودن نمونه ها 68

4-2-3: نتیجه نهایی PCR.. 69

4-2-4: مشاهده سوش جهش یافته Hib‾ در میان نمونه ها 72

4-3: نتایج سنجش PRP  به روش بیال. 72

4-4: نتایج Real-time PCR.. 73

4-4-1: کمیت سنجی نسبی: 74

 

 

4-4-2: کمیت سنجی مطلق: 77

4-5: نتایج تعیین ژنوتیپ: 82

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1: بحث و نتیجه گیری.. 84

5-3: پیشنهادات… 87

منابع  …   89

خلاصه انگلیسی.. 98

فهرست جداول

جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V   7

جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا 8

جدول 3-1: لیست پرایمرها برای تایید Hib.. 48

جدول 3-2: برنامه PCR.. 50

جدول 3-3: مواد PCR.. 52

جدول3-4: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای Real time PCR.. 58

جدول3-5: مواد واکنش برای Real-time PCR.. 61

جدول3-6 : برنامه واکنش Real-time PCR.. 61

جدول 3-7: پرایمر های مورد استفاده برای تعیین ژنوتیپ نمونه های منتخب… 63

جدول 3-8: برنامه دمایی واکنش PCR برای پرایمرهای K  و L.. 63

جدول 4-1: لیست نمونه ها و  نتایج PCR.. 70

جدول 4-2: میزان PRP نمونه های هموفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 73

جدول 4-3 : نمونه های منتخب و میزان PRP. 74

جدول4-4: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و قطعه IS106 توسط Real-time PCR.. 75

جدول4-5: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و ژن capb توسط Real-time PCR.. 75

جدول4-6: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه rpoB.. 78

جدول 4-7: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه capB.. 78

جدول 4-8:  نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه IS1016. 78

جدول4-9: نتایج کمیت سنجی مطلق (تعداد کپی) جایگاه های rpoB, IS1016 و capB 79

جدول 4-10 : تعداد کپی جایگاه های capb و IS1016  نسبت به جایگاه تک کپی rpoB 80

فهرست تصاویر

شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد. 5

شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV.. 7

شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های a-f). 10

شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد. 14

شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستن   18

شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd.. 20

شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f. 21

شکل 1-8: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده 24

شکل 1-9 : درخت تکاملی سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 26

شکل1-10 : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه cap. 28

شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سایبرگرین.. 30

شکل1-12: مکانیسم عمل SYBR Green به عنوان عامل متصل شونده به DNA.. 31

شکل1-13: رسم منحنی استاندارد. 33

شکل 3-1: ویال های آماده برای PCR روی یخ.. 52

شکل 4-1: رشد باکتری در حضور دیسک XV  و عدم رشد در حضور دیسک X و V.. 65

شکل 4-2: رنگ آمیزی گرم نمونه ها نشان دهنده کوکوباسیل های گرم منفی.. 66

شکل 4-3: نتایج PCR برای ست پرایمر A و B 67

شکل 4-4: نتایج PCR برای ست پرایمر C  و D.. 69

شکل 4-5: مدل های پیشنهادی برای جایگاه capb  در نمونه های انتخاب شده 81

شکل4-6: نتایج PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها 82

فهرست نمودارها

نمودار 4-1: بیان نسبی capb نسبت به ژن مرجع rpoB…………………………………………………… 76

نمودار 4-2: بیان نسبی IS1016 نسبت به ژن مرجع rpoB………………………………………………….. 76

نمودار 4-3: تعداد کپی در دو جایگاه capB و IS1016 نسبت به جایگاه rpoB در نمونه ها……… 80

خلاصه فارسی

هموفیلوس آنفلونزای تیپ‌ب (Hib) از مهمترین عوامل ایجاد مننژیت باکتریال در نوزادان و کودکان می‌باشد. مهمترین عامل بیماری‌زایی این باکتری کپسول پلی‌ساکاریدی از جنس PRP می‌باشد که تولید آن تحت کنترل گروهی از ژنها می‌باشد که در جایگاهی به نام capb قرار دارند. واکسیناسیون علیه این بیماری در بیشتر کشورهای جهان انجام شده ولی ایران هنوز به طرح واکسیناسیون سراسری نپیوسته است، به همین دلیل تولید واکسن بومی هموفیلوس آنفولانزا یک ضرورت محسوب می‌شود. هدف از این مطالعه آنالیز مولکولی ژنوم باکتری برای انتخاب یک سویه بومی واکسینال می‌باشد. در این تحقیق ابتدا نمونه‌های مشکوک به روش PCR و با استفاده از 4 جفت پرایمر اختصاصی شناسایی شد، میزان PRP نمونه‌ها به روش بیال اندازه‌گیری شد، سپس تعداد کپی جایگاه cap در نمونه‌های منتخب به روش Real Time PCR و با استفاده از 3 جفت پرایمر طراحی شده برای مناطق IS1016، capb و ژن تک‌کپی rpoB با متد Abslute Quantification مشخص شد. در نهایت ژنوتیپ نمونه‌های منتخب با استفاده از دو جفت پرایمر اختصاصی مشخص شد.از میان 30 نمونه 18 مورد Hib ،11 مورد غیر از هموفیلوس آنفلونزا و یک مورد  Hib‾ تشخیص داده شد. از میان 5 نمونه منتخب دو نمونه دارای 3 کپی از جایگاه cap بوده و 3 نمونه دارای دو کپی از این جایگاه تشخیص داده شدند. در مرحله آخر تمام 5 نمونه ژنوتیپ I تشخیص داده شدند. در این مطالعه برای اولین بار در ایران تعیین تعداد کپی و ساختار ژنوم جایگاه cap در سویه‌های بومی انجام شد.

کلمات کلیدی: هموفیلوس آنفلونزا، Real time PCR، مننژیت ، Hib

فصل اول

کلیات

1-1: تاریخچه

هموفیلوس آنفلونزا برای اولین بار در سال 1892 به وسیله فایفر جدا گردید و تا اوایل دهه 1930، اکثر دانشمندان آن را عامل مولد آنفلونزای اپیدمیک می دانستند. زیرا عموماً همراه با این بیماری بدست می آمد(8). در سال 1933 مسلم گرید که عامل بیماری آنفلونزا ویروس است و این باکتری یک مهاجم ثانوی در اپیدمیها می باشد(1). البته در پاندمی های اخیری که ویروس آنفلونزا عامل آن بوده، نقش نزدیک از این باکتری با ویروس آنفلونزا دیده نشده است و بدین دلیل مسئله سینرژیسمی بین ویروس و باکتری در بیماری های انسانی ناشناخته به نظر می رسد. بنابر این نام آنفلونزا اهمیت اتیولوژیک ندارد(8). آنفلونزا معمولا منصوب به عنوان ” flu”، یک بیماری ویروسی است که بوسیله التهاب حاد مسیر هوایی ناحیه فوقانی دستگاه تنفسی مشخص می گردد. علائم، اغلب با التهاب شدید غشاء مخاط بینی، سردرد، برونشیت و درد عضلانی عمومی شدید[1] پیشرفت می کند(48).

کاملترین مطالعات توسط مارگارت پیتمن بین سالهای 1930 تا 1940 صورت گرفت ، او فیزیولوژی، بیماریزایی، مصونیت، اپیدمیولوژی و خصوصیات این باکتری را به صورت کامل شرح داد(1). نام جنس هموفیلوس از دو ریشه یونانی هم  [2]به معنای خون و فیلوس [3]به معنای دوست داشتن گرفته شده است(20) . بر اساس کتاب باکتریولوژی برِگِی[4]، 10 گونه از هموفیلوسها در ارتباط با انسانها نام گذاری شده اند که یکی از آنها گونه آنفلونزا می باشد. بعلاوه 6 گونه نیز در ارتباط با حیوانات بوده و 3 گونه نیز حالت نامشخص دارند.