1-1- شیر………………………………………………………………………………………………… 2

1-2- ترکیبات شیر………………………………………………………………………………………………………………… 4

1-3- پروتئین­های شیر…………………………………………………………………………………………………………. 5

1-3-1- پروتئین­های آب پنیر………………………………………………………………………………………… 6

1-3-2- کازئین­ها…………………………………………………………………………………………………………….. 7

1-3-3- کازئین­بتا…………………………………………………………………………………………………………….. 9

1-4- فعالیت­های زیستی کازئین­ها…………………………………………………………………………………….. 11

1-4-1- فعالیت چاپرون کازئین­های شیر…………………………………………………………………….. 11

1-4-2- پپتیدهای فعال زیستی……………………………………………………………………………………. 12

1-4-2-1- پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………………………………. 12

1-4-2-2- منابع اصلی پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………………….. 12

1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی…………………………………………….. 12

1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون……………………………………………………………… 12

1-4-2-3-2- فعالیت آنتی­اکسیدانی………………………………………………………………… 14

1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد…………………………………………………………………….. 15

1-5-1- عدم تحمل لاکتوز……………………………………………………………………………………………. 15

1-5-2- آلرژی به پروتئین­های شیر……………………………………………………………………………… 16

عنوان                                                                                                                      صفحه

1-5-2-1- معرفی انواع آزمون­های رایج جهت مطالعه­ی فرآیند آلرژی……………… 18

1-5-2-2- آزمون الایزا……………………………………………………………………………………………. 19

1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین­ها……………………………………………………………………………. 20

فصل دوم: مروری بر پژوهش­های پیشین………………………………………. 23

فصل سوم: مواد و روش­های تحقیق

3-1- مواد مصرفی………………………………………………………………………………………… 27

3-2- تهیه­ی محلول­ها……………………………………………………………………………. 28

3-2-1- تهیه­ی محلول­های کازئینی، کازئین­بتا و تعیین غلظت آن­ها………………………. 28

3-2-2- تهیه­ی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با

 استفاده از کازئین­بتا……………………………………………………………………………. 28

3-2-3- تهیه­ی محلول­های مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی………………………………………… 30

3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد………………………………………………………………… 30

3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)……………………………………………… 30

3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید…………………………………………… 31

3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………………………………… 31

3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار…………………………………………………………………… 31

3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلی­لیتر……………………………………………… 31

3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2………………………………………………………………………………. 32

3-2-3-8- تهیه 100 میلی­لیتر محلول کوماسی­بلو……………………………………………… 33

3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل………………………………………………………………………… 33

3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلی­لیتر……………………………………………………. 33

3-2-5- تهیه محلول فلورسامین…………………………………………………………………………………… 34

 عنوان                                                                                                                      صفحه

3-2-6- تهیه محلول ANS…………………………………………………………………………………………… 35

3-2-7-  تهیه محلول ABTS رادیکال…………………………………………………………………………. 36

3-2-8- تهیه عصاره­ی ACE از پودر استون شش خرگوش……………………………………… 37

3-3-روش­ها………………………………………………………………………………………… 38

3-3-1- تخلیص کازئین­بتا شیرگاو……………………………………………………………………………….. 38

3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان……………………………………………………………. 39

3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE…………………………… 40

3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش…………………………………………………………………….. 40

3-3-5- قندی کردن کازئین­بتا و کازئین­های شیرگاو به روش غیرآنزیمی………………. 41

3-3-6- آزمون­های OPA و فلورسامین برای تایید فرآیند

قندی شدن غیرآنزیمی………………………………………………………….. 41

3-3-7- مطالعه­ی فلورسانس ذاتی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………………. 42

3-3-8- مطالعه­ی فلورسانس عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی……………….. 43

3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئین­های بتای قندی و غیرقندی،

با استفاده از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………. 43

3-3-10- مطالعه­ی فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………… 44

3-3-11- هضم کازئین­های شیرگاو و کازئین­بتای قندی و غیرقندی

به وسیله­ی آنزیم­های تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی…………………………………. 44

3-3-12- مطالعه­ی فعالیت آنتی­اکسیدانی کازئین­های شیرگاو کازئین­بتای

 قندی و غیرقندی…………………………………………………………………………. 45

3-3-13- مطالعه­ی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ی کازئین­بتا

 قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها……………………………………… 47

3-3-14- مطالعه­ی توان آلرژی­زایی کازئین­ها و کازئین­بتای قندی

 و غیرقندی……. 47

عنوان                                                                                    صفحه

3-3-15- آزمون آماری…………………………………………………………………….. 48

 فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت­های زیستی

(چاپرونی، آنتی­اکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژی­زایی کازئین­بتا………………………………. 50

4-1-1- تخلیص پروتئین کازئین­بتا………………………………………………………………………………. 50

4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان……………………………………………………………… 51

4-1-3- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا

در حضور ماده­ی احیا کننده………………………………………………… 52

 

 

 

4-1-3-1- مطالعه­ی قندی شدن کازئین­بتا با استفاده از ترکیب OPA……………… 53

4-1-3-2- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا با استفاده

 از ترکیب فلورسامین…………………………………………….. 54

4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرآیند

قندی شدن غیرآنزیمی کازئین­بتا……………………………………………………………………………… 55

4-1-4- مطالعه­ی فلورسانس ذاتی و عارضی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی…… 56

4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با استفاده

از دستگاه دورنگ نمایی دورانی………………………………………………………………………………………. 58

4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی………………………. 60

4-1-7- هضم آنزیمی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی با آنزیم­های

 تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 62

4-1-7-1- تایید فرآیند هضم آنزیمی با استفاده از ژلSDS-PAGE

(15درصد) احیایی……………………………………………………………………………………………………… 63

عنوان                                                                                                                      صفحه

4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های بتای قندی

 و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………… 65

4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیله­ی کازئین­های

بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آن­ها………………………… 71

4-1-8- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای

حاصل از هضم آنزیمی آن­ها…………………………………………………………………………………………… 73

4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتی­اکسیدانی

 و آلرژی­زایی کازئین­های شیرگاو…………………………………………………………………………………………. 77

4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو……………………………………………………….. 77

4-2-2- تایید فرآیند قندی شدن کازئین­های شیرگاو……………………………………………….. 77

4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید

 قندی شدن غیرآنزیمی…………………………………………………………………………………………….. 77

4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعه­ی قندی شدن غیرآنزیمی

کازئین­های شیرگاو……………………………………………………………………………………………………… 78

4-2-3- هضم آنزیمی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیم­های

 تریپسین و کیموتریپسین………………………………………………………………………………………………. 80

4-2-4- مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدان کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو

 و پپتیدهای حاصل از هضم آن­ها………………………………………………………………………………….. 82

4-2-5- مطالعه آلرژی­زایی کازئین­های قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای

 حاصل از هضم آنزیمی آن­ها به وسیله­ی دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین………….. 86

 

عنوان                                                                                                                      صفحه

خلاصه­ی نتایج ………………………………………………………………………………. 90

 نتیجه­گیری نهایی……………………………………………………………………………………. 91

فهرست منابع و مآخذ       92

شیر

شیر یک مایع زیستی پیچیده متشکل از آب، پروتئین، چربی، کربوهیدرات، مواد معدنی و برخی ترکیبات فعال زیستی از جمله آنزیم­ها و ویتامین­ها می­باشد که به عنوان اولین ماده غذایی برای نوزاد، بوسیله غدد پستانی موجودات پستاندار ساخته می­شود. در اوایل دوران شیردهی، شیر آغوز[1] نامیده می­شود که سرشار از آنتی­بادی­هایی است که خطر ابتلای نوزاد به بسیاری از بیماری­ها را کاهش می­دهد. شیر به عنوان اولین ماده­ی غذایی برای نوزاد شامل اکثر ترکیبات ضروری و مورد نیاز برای رشد و نمو است. در شکل (1-1) ترکیبات اصلی موجود در شیر مشاهده می­شود (Pehrsson، 2000).

شکل1-1- نمایی از ترکیبات موجود در شیر.

شیر نه تنها به عنوان یک ماده­ی غذای برای تغذیه­ی نوزاد تازه متولد شده مطرح است بلکه به عنوان یک ماده­ی غذایی ارزشمند و مغذی برای انسان در تمام کشورهای جهان استفاده می شود. امروزه در سراسر جهان دامداری­های بزرگ در سطح وسیع به تولید شیر و محصولات لبنی مشغولند به طوریکه در سال 2011 میزان تولید شیر در جهان 730 میلیون تن بوده است. هندوستان به عنوان بزرگترین کشور تولید و مصرف کننده شیر در جهان و نیوزلند، 28کشور عضو اتحادیه اروپا، استرالیا و ایالات متحده­ی آمریکا به عنوان بزرگترین صادر کننده های شیر و محصولات لبنی می­باشند. همچنین چین و روسیه به عنوان بزرگترین واردکنندگان شیر و محصولات لبنی در جهان شناخته می­شوند (Blasko، 2011).

 

1-2- ترکیبات شیر

همانطور که در بالا ذکر شد، شیر یک ماده­ی غذایی غنی از پروتئین، کربوهیدرات، چربی و ترکیبات معدنی است.  درصد، اندازه و نوع هر یک از ترکیبات تشکیل دهنده شیر بسته به گونه جاندار متفاوت است. به عنوان مثال درصد پروتئین شیر انسان نسبت به شیر گاو پایین­تراست در صورتی که درصد کربوهیدرات و چربی آن بالاتر می­باشد. شیر اسب و الاغ کمترین میزان چربی را در بین گونه­های مختلف دارد. همچنین شیر انسان فاقد پروتئین بتالاکتوگلوبولین[2] است، درصورتی که این پروتئین یکی از پروتئین­های اصلی آب پنیر است و به مقدار قابل ملاحظه­ایی در شیرگاو دیده می­شود. در جدول (1-1) درصد ترکیبات موجود در شیر برخی جانوران مشاهده می­شود (Nelson و همکاران 1951 ، Barlowska و همکاران 2011).

جدول1-1- ترکیبات سازنده شیر جانوران مختلف بر حسب درصد.

 

1-3- پروتئین­های شیر

اکثر پروتئین­های شیر در طول زمان شیردهی بوسیله­ی سلول­های پوششی غدد پستانی تولید و ترشح می­شود. این سلول­ها علاوه بر پروتئین، ترکیبات دیگری مانند چربی (تری­آسیل گلیسرول[3] و دی­گلیسرول[4]) و کربوهیدرات (لاکتوز[5]) را نیز تولید و ترشح می­کنند (Bouguyo و همکاران 2006، De Kruif و همکاران 2003).

پروتئین­های شیر از نظر ارزش غذایی و فعالیت زیستی بسیار حائز اهمیت هستند و به دو گروه کازئین­ها (آلفا S1، آلفا S2، بتا و کاپا کازئین) و پروتئین­های آب­پنیر (آلفالاکتالبومین[6]، بتا لاکتوگلوبولین، سرم آلبومین[7] و ایمونوگلوبولین[8]) تقسیم می­شوند. کازئین­های شیر گاو 80 درصد و پروتئین­های آب­پنیر بین20 تا 45درصد کل پروتئین­های شیر انسان را تشکیل
می­دهند ( Kunz و همکاران 1990، Wong و همکاران 1996).

شکل1-2- پروتئین­های تشکیل دهنده شیرگاو.

1-3-1- پروتئین­های آب­پنیر

پروتئین­های آب­پنیر از نوع کروی هستند که حدود 20 درصد پروتئین­های شیر را شامل می شوند. از لحاظ ساختاری این پروتئین­ها دارای مقدار قابل توجهی مارپیچ­آلفا[9] در ساختارشان می­باشند.

آمینواسید­های اسیدی، بازی، آبگریز[10] و آبدوست[11] به صورت نسبتا متعادل در طول زنجیره ی پلی­پپتیدی این پروتئین­ها وجود دارد. این پروتئین­ها در محیط آبی شیر  به صورت محلول هستند (Evans، 1982).

پروتئین­های آب­پنیر شامل بتالاکتوگلوبولین، آلفالاکتالبومین، ایمونوگلوبولین، آلبومین سرمی، لاکتوفرین[12] و لاکتوپراکسیداز[13] می­باشد که غلظت و درصد این پروتئین­ها در شیر نسبت مستقیم با نوع آب­پنیر شامل اسیدی با pH پایین تر از 1/5 و بازی با pH بالاتر یا مساوی 6/5، منبع شیر ( گونه­ی حیوان)، زمان سال، نوع خوراک حیوان و مرحله­ی شیردهی دارد (Pintado 2001).

فعالیت­های زیستی مختلفی به پروتئین­های آب­پنیر نسبت داده شده است که از بین این فعالیت­ها، خواص ضد میکروبی این پروتئین­ها به میزان زیادی بررسی شده است (Clare وهمکاران 2003).