دانلود پایان نامه دكتری : تشخیص عوامل اصلی باکتریایی اندومتریت پس از زایش به روش multiplex PCR در گاوهای شیری
دوره پس از زایمان به دلیل اثراتی که بر کارایی تولیدمثلی و آبستنی مجدد دارد، به عنوان یک مرحله مهم در زندگی تولید مثلی گاو ماده محسوب میشود. آلودگی رحم به باکتریها، به طور معمول در طی دو هفته ابتدایی پس از زایش رخ میدهد (Noakes et al. 2009; Sheldon and Dobson 2004). 80 تا 100 درصد گاوها آلودگی باکتریایی رحم را در دو هفته اول پس از زایش دارند (Földi et al. 2006). در این مدت دامنه وسیعی از فلور میکروبی در رحم تکثیر میکنند. هر چند رحم بیشتر گاوها در فرایندهای بازسازی رحم و بازگشت آن به اندازه طبیعی، در طی پنج هفته اول پس از زایش، از این آلودگیهای باکتریایی پاک میشوند اما در تعدادی از گاوها این آلودگیها توسعه پیدا کرده و عفونتهای رحمی قابل تشخیص با معاینه بالینی را ایجاد میکنند (Noakes et al. 2009; Sheldon et al. 2006a).
اندومتریت پس از زایش به صورت التهاب محدود به اندومتریوم (لایه داخلی رحم) که 21 روز یا بیشتر پس از زایش و بدون نشانههای بیماری عمومی رخ میدهد، تعریف شده است (Sheldon et al. 2006a). تشخیص اندومتریت بالینی با قطر گردن رحم بیش از 5/7 سانتیمتر در ملامسه راست رودهای بعد از روز 20 پس از زایش یا از حضور ترشحات مهبلی موکوسی-چرکی یا چرکی بعد از روز 26 پس از زایش تعریف شده است (LeBlanc et al. 2002a).
میزان شیوع اندومتریت در کشورهای مختلف بسیار متفاوت بوده است. این میزان از 5/4-6/2 در اسپانیا (Lopez-Gatius 2003)، 10 درصد در بریتانیا (Noakes et al. 2009)، 25 درصد در ژاپن (Gautam et al. 2009)، تا 53 درصد در ایالات متحده (Gilbert et al. 2005) متغیر بوده است که این تفاوت میتواند به دلیل عدم توصیف روشهای تشخیصی، معیارهای متفاوت درجه بندی عفونتهای رحمی، دوره پس از زایشی که هنگام تشخیص عفونت گاو در آن قرار داشته، تعداد زایش گاو و مدیریت متفاوت گلهها باشد (Lewis 1997; Noakes et al. 2009). در مطالعات قبلی در گاوداریهای ایران میزان وقوع اندومتریت بالینی درجه 1 تا 3 بیش از 50 درصد بود (احمدی و همكاران، اطلاعات منتشر نشده).
اندومتریت تاثیرات نامناسب بر تولیدمثل و باروری گاو گذاشته و خسارات اقتصادی فراوانی را وارد میآورد. حضور باکتری در رحم، التهاب و آسیبهای بافتی اندومتریوم را در پی دارد و سبب تأخیر در بازسازی رحم و همچنین به خطر افتادن حیات رویان میشود (Azawi 2008; Sheldon et al. 2006a). همچنین عفونت باکتریایی رحم و یا مواد تولید شده از این باکتریها سبب سرکوب ترشح LH هیپوفیز و
نقص در عملکرد و رشد فولیکولهای تخمدانی پس از زایمان و در نتیجه اختلال در تخمکگذاری میشود (Opsomer et al. 2000; Sheldon et al. 2002b). بنابراین اندومتریت سبب کاهش احتمال باروری شده و افزایش فاصله زایش تا اولین تلقیح و افزایش نسبت تلقیح به ازای آبستنی (از 2 به 42/2) و افزایش فاصله زایشها (10 تا 31 روز) را در پی دارد (Azawi 2008; LeBlanc et al. 2002a; Noakes et al. 2009). گاوهای مبتلا به ترشحات مهبلی چرکی برای آبستن شدن به میانگین 30 روز زمان بیشتر نسبت به گاوهای غیر مبتلا نیاز دارند که حداقل ضرر اقتصادی طولانی شدن روزهای باز را دارد که حدود 3 دلار در روز میباشد (Dubuc 2011). پس اندومتریت میتواند سبب کاهش میزان باروری و افزایش نرخ حذف به دلایل ناباروری شود. نتیجه اینکه اندومتریت میتواند اثر فراوانی در کاهش سودآوری گلههای گاو شیری داشته باشد. این خسارات به دلیل افزایش فاصله زایمان تا آبستنی مجدد، افزایش میزان حذف، کاهش تولید شیر و تحمیل هزینههای درمان میباشد (Drillich 2006; LeBlanc et al. 2002a) به گونهای که خسارات آن را برای هر گاو مبتلا 166 پوند (Noakes et al. 2009) محاسبه کردهاند.
عوامل بیماریزای اندومتریت بسیار پیچیده هستند. بسیاری از مطالعات پیشنهاد کردهاند که باکتریهای بیماریزا نقش مهمی در بروز و وخیم شدن اندومتریت دارند (Sun et al. 2011). معمولترین شروع کنندههای عفونت اندومتریت باکتریهای بیماریزای فرصت طلب غیر اختصاصی هستند که در اطراف زمان زایمان و پس از آن رحم را آلوده میکنند (Sheldon et al. 2006a). به نظر میرسد عفونت رحم به Escherichia coli در اوایل دوره پس از زایش، راه را برای عفونی شدن توسط سایر باکتریها هموار میکند (Westermann et al. 2010; Williams et al. 2005). متعاقب آن رشد زیاد باکتریهای بیماریزایی چون pyogenes Trueperella (Arcanobacterium pyogenes) (که معمولا باکتریهایی چونFusobacterium necrophorum و Prevotella melaninogenicus همراه با آن هستند) به لایههای اندومتریوم نفوذ میکنند (Drillich 2006; Noakes et al. 2009; Sheldon et al. 2006a). میزان عفونت ایجاد شده و نتیجه آلودگی را گونه باکتری بیماریزا، میزان باکتری وارد شده و توانایی گاو برای بروز پاسخ ایمنی مناسب تعیین میکنند که میتواند از عفونت رحمی شدید همراه با به خطر افتادن زندگی تا عفونت خفیف لایه داخلی رحم متغیر باشد (Noakes et al. 2009; Sheldon and Dobson 2004). گرچه در پایدار شدن و باقی ماندن عفونت در رحم عواملی چون مساعد بودن محیط رحم، فاکتورهای ژنتیکی و ایمنی ذاتی و اکتسابی حیوان دخالت دارند اما شدت اندومتریت و آسیبهای وارده به رحم ارتباط مستقیمی با جنس و گونه باکتریهای آن دارد. Trueperella pyogenes معمولترین باکتری مرتبط با بیماریهای رحمی و اندومتریت است (Bicalho et al. 2010; Sheldon et al. 2004; Yavari et al. 2007). در کنار آن باکتریهایی چون Fusobacterium necrophorum و melaninogenicus Prevotella و Escherichia coli از دیگر باکتریهای بسیار مطرح در آسیبهای رحمی و در رده اول بیماریزایی برای رحم هستند (Sheldon and Dobson 2004; Williams et al. 2005). در ضمن این باکتریها به رشد همدیگر کمک کرده و اثرات هم را تشدید میکنند (Sheldon and Dobson 2004; Westermann et al. 2010). به گونهای که T. pyogenes کمک به ایجاد محیط بیهوازی برای رشدF. necrophorum وmelaninogenicus P. میکند. F. necrophorum اندوتوکسین کشنده سلولهای دفاعی را تولید میکند که توانایی سیستم دفاعی میزبان برای پاکسازی رحم از T. pyogenes را محدود میکند. در همین حال melaninogenicus P. مواد تداخل کننده در فاگوسیتوز را تولید میکند (Sheldon and Dobson 2004). در نتیجه این سه باکتری معمولا در کنار هم و در ارتباط با هم جداسازی شدهاند.
با توجه به اینکه اندومتریت اثری بر سلامت ظاهری گاو مبتلا ندارد از روشهای گوناگونی برای تشخیص آن در گاو استفاده کردهاند (Youngquist and Threlfall 2007) که شامل: ملامسه رحم از راه راستروده (Drillich 2006; Lewis 1997)، بررسی حضور ترشحات چرکی در واژن و دهانه خارجی گردن رحم (LeBlanc et al. 2002a; Williams et al. 2005)، اولتراسونوگرافی (Barlund et al. 2008; Oral et al. 2009)، بیوپسی رحم و مطالعات آسیبشناسی (Bonnett et al. 1991)، مطالعات سلول شناسی (Ahmadi et al. 2005; Oral et al. 2009; Yavari et al. 2009) و مطالعات میکروبشناسی (Földi et al. 2006; Yavari et al. 2007) میباشد اما این روشها بیشتر برای تایید اندومتریت استفاده میشوند و کمتر برای تشخیص عامل بیماریزا قابل استفاده هستند یا اینکه وقتگیر، با حساسیت پایین و پیچیده هستند.
باید توجه داشت که تشخیص قطعی اندومتریت بر اساس معاینه بافتشناسی و آسیبشناسی از نمونههای بیوپسی اندومتر و یا با بررسی باکتریشناسی نمونههای جمعآوری شده از مجرای رحم قابل اطمینان است. با توجه به اینکه بیوپسی بر بافت رحم و گردن رحم اثرات نامطلوب گذاشته و ناباروری ایجاد میکند، استفاده از آن روشی قابل توصیه و مناسب نمیباشد (Youngquist and Threlfall 2007). اما در کشت باکتریها نیز محدودیتهایی وجود دارد که استفاده از آنها را دچار ابهام میکند. به عنوان مثال، برای کشت برخی باکتریها مثلF. necrophorum باید شرایط خاص (اجبار در استفاده از محیط کشت اختصاصی، ایجاد شرایط خاص بیهوازی و همچنین مدت زمان طولانی مورد احتیاج برای کشت) فراهم شود که این روش را تبدیل به فرایندی زمانبر، هزینهبر و با زحمت زیاد کرده است. نکته مهم دیگر اینکه در مطالعات باكتری شناسی جدا شدن باكتری به عنوان دلیلی قاطع مبنی بر وجود عفونت در رحم تلقی میشود، چنانچه از آن به عنوان یک شاخص برای تعیین موارد مثبت کاذب روش واژینوسکوپی استفاده شده است (Westermann et al. 2010) ولی در صورتی كه چرك مشاهده و باكتری جدا نشود نمیتوان نتیجه گرفت که وجود چرك، ناشی از التهاب غیر عفونی است به خصوص در مورد باکتریهای سخت رشد و بیهوازی چونF. necrophorum وmelaninogenicus .P. در بسیاری مطالعات تعداد زیادی نمونه رحمی بدون رشد هیچ گونه باکتری گزارش شده است (Ahmadi et al. 2007; Westermann et al. 2010). از جمله در مطالعه یاوری و همکاران از كشت رحم 89 راس گاو مبتلا به اندومتریت بالینی تهیه شده از گاوداریهای 5 استان، فقط از 35 مورد (3/39 درصد) باكتری جدا شد و تنها در 19 گاو دو باکتری بیماریزای اصلی (T. pyogenes و E. coli) مشاهده شد (Yavari et al. 2007). در صورت مشاهده چرك و جدا نشدن باكتری (7/60 درصد) نمیتوان نتیجه گرفت که وجود چرك، ناشی از التهاب غیرعفونی است. بنابراین معرفی و استفاده از روشهایی که کاستیها و مشکلات مطالعات باکتری شناسی بر مبنای کشت را از میان بردارد، دارای اهمیت بسیار است و احتیاج است که تعیین شود آیا روشهای پیچیدهتر مثل PCR دقت تشخیص را افزایش خواهند داد (Westermann et al. 2010).
در حال حاضر PCR به عنوان یک فنآوری قدرتمند برای تشخیص و توصیف میکروارگانیسمها بدون احتیاج به کشت تایید شده است (Guo et al. 2012). برخی تلاشها برای شناسایی باکتریها از ترشحات رحمی توسط PCR صورت گرفته است (Bicalho et al. 2012; Guo et al. 2012; Liu et al. 2009). به کار گرفتن روش multiplex PCR سبب سهولت و افزایش سرعت انجام کار و هزینه کمتر نسبت به روش استاندارد میشود (Tramuta et al. 2011) اما پروتکلهای اندکی برای تشخیص عوامل عفونی ترشحات اندومتریت به روش multiplex PCR پیشنهاد شدهاند (Sun et al. 2011).
بنابراین اهداف این مطالعه در ابتدا جستجوی باکتریهای بیماریزای اصلی رحم
(T. pyogenes، F. necrophorum، melaninogenicus P. و E. coli) در گاوهای مبتلا به اندومتریت به روش PCR بود. در روش PCR بررسیها مستقیم بر روی ژنوم نمونه صورت
میگیرد و در صورت حضور باکتری قطعههای خاص از DNA آن را تکثیر کرده و حضور آن را با حساسیت بسیار معین میکند. این روش شناسایی باکتریهایی را که در محیطهای کشت سخترشد و دیر رشد هستند مثل F. necrophorum وmelaninogenicus P. امکانپذیر میسازد. چنانچه در مطالعهای وسیع كشت باكتریایی از رحم گاوهای مبتلا به اندومتریت بالینی انجام داده شد اما دو باكتری نامبرده فوق جدا نشدند (Yavari et al. 2007). همچنین تلاش شد تا یک پروتکل multiplex PCR برای این باکتریهای بیماریزا طراحی شود. بررسی ركورد شاخصهای تولیدمثلی در راستای شناسایی اثرات ابتلا با باکتریهای اصلی بیماریزای رحم گاوهای شیری نیز از دیگر اهداف مطالعه بود.
نسخه قابل چاپ | ورود نوشته شده توسط نجفی زهرا در 1399/10/26 ساعت 02:22:00 ب.ظ . دنبال کردن نظرات این نوشته از طریق RSS 2.0. |