1-1- هورمون انسولین …………………………………………………………………………………………………………. 2

1-1- 1- ساختار هورمون انسولین ……………………………………………………………………………….. 4

1-1-1-1- ساختار اول انسولین……………………………………………………………………………….. 4

1-1-1-2- ساختار دوم انسولین………………………………………………………………………………. 5

1-1-1-3-  ساختار سوم انسولین……………………………………………………………………………. 6

1-1-1-4-  ساختار چهارم انسولین…………………………………………………………………………. 6

1-1-2- سنتز هورمون انسولین……………………………………………………………………………………… 8

1-1-3-  ترشح هورمون انسولین…………………………………………………………………………………… 9

1-1-4- اشکال مختلف هورمون انسولین ……………………………………………………………………. 10

1-1-5- عملکرد زیستی هورمون انسولین ………………………………………………………………….. 11

1-1-6- گیرنده هورمون انسولین…………………………………………………………………………………. 13

1-2- بیماری دیابت قندی…………………………………………………………………………………………………… 15

1-2-1- دیابت نوع- I…………………………………………………………………………………………………….. 15

1-2-1-1- دیابت آدیوپاتیک……………………………………………………………………………………. 16

1-2-2- دیابت نوع- II…………………………………………………………………………………………………… 16

1-2-3- دیابت حاملگی………………………………………………………………………………………………….. 17

1-2-4- عوارض بیماری دیابت ……………………………………………………………………………………. 17

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

1-3- آسپرین ………………………………………………………………………………………………………………………. 19

1-3-1- ساز و کار عملکرد آسپرین …………………………………………………………………………….. 21

1-4- تا خوردگی و تجمعات پروتئینی……………………………………………………………………………….. 22

1-4-1- تجمعات منظم پروتئینی: فیبر آمیلوئیدی…………………………………………………….. 25

1-4-2- مراحل تشکیل فیبریل ها……………………………………………………………………………….. 26

1-4-3- پدیده فیبریلاسیون هورمون انسولین…………………………………………………………….. 28

1-5- نقش چاپرون ها در جلوگیری از فرآیند توده ای شدن

و فیبریلاسیون پروتئین ها……………………………………………………………………………………………………. 32

1-5-1- چاپرون های آلفا کریستالین و بتا کازئین……………………………………………………… 32

 

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین…………………………………………………………………………. 35

 

فصل سوم: مواد و روش های تحقیق

3-1- مواد مصرفی و رده ی سلولی…………………………………………………………………………………….. 40

3-1-1- مواد مصرفی……………………………………………………………………………………………………… 40

3-1-2- رده ی سلولی…………………………………………………………………………………………………… 41

3-2- تهیه محلول ها……………………………………………………………………………………………………………. 41

3-2-1- تهیه محلول های مورد نیاز کشت سلول سرطانی…………………………………………. 41

3-2-1-1- تهیه محلول MTT………………………………………………………………………………… 41

3-2-1-2- تهیه محلول تریپان بلو جهت رنگ آمیزی و شمارش

سلول های زنده و غیر زنده……………………………………………………………………………………… 41

3-2-1-3- تهیه محلول SDS-DMF……………………………………………………………………… 42

3-2-2- تهیه ی محلول های پروتئینی………………………………………………………………………… 42

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

3-2-2-1- تهیه ی محلول انسولین ………………………………………………………………………. 42

3-2-2-2- تهیه محلول های بتاکازئین و آلفاکریستالین………………………………………. 43

3-2-3-  تهیه ی محلول های مورد نیاز………………………………………………………………………. 43

3-2-3- 1-  تهیه محلول بافر فسفات…………………………………………………………………….. 43

3-2-3-2- تهیه ی محلول استوک ANS……………………………………………………………… 44

3-2-3-3-  تهیه ی محلول استوک تیوفلاوین T ………………………………………………… 45

3-2-3-4- تهیه محلول استوک کنگورد………………………………………………………………… 46

3-2-3-5-  تهیه محلول OPA………………………………………………………………………………. 47

3-2-3-6-  تهیه محلول فلورسامین………………………………………………………………………. 48

3-2-4- تهیه محلول های مورد نیاز ژل الکتروفورز …………………………………………………… 48

3-2-4-1- تهیه محلول آکریل آمید و بیس آکریل آمید……………………………………… 48

3-2-4-2-  تهیه محلول 20 درصد SDS…………………………………………………………….. 48

3-2-4-3-  تهیه محلول 10 درصد آمونیوم پرسولفات (APS) …………………………. 49

3-2-4-4- تهیه محلول بافر تریس 5/1 مولار ……………………………………………………… 49

3-2-4-5-  تهیه محلول بافر تریس 5/0 مولار ……………………………………………………. 49

3-2-4-6-  تهیه محلول بافر تانک…………………………………………………………………………. 50

3-2-4-7-  تهیه بافر نمونه X2 ……………………………………………………………………………. 50

3-2-4-8-  تهیه محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو………………………………………………… 51

3-2-4-9- تهیه محلول رنگ زدای کوماسی بلو……………………………………………………. 51

3-3- روش های استفاده شده در این پژوهش………………………………………………………………….. 52

3-3-1-  تخلیص آلفا کریستالین ………………………………………………………………………………… 52

3-4- روش های تحقیق………………………………………………………………………………………………………. 53

3-4-1- فرآیند استیلاسیون هورمون انسولین پانکراس گاوی با آسپیرین……………….. 53

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

3-4-2- الکتروفورز ژلی هورمون انسولین استیله و غیر استیله

به منظور بررسی میزان استیلاسیون و تشکیل توده های پروتئینی

با وزن مولکولی بالا………………………………………………………………………………………………………….. 53

3-4-3- تعیین گروه های آمین آزاد/ غیر واکنش دهنده در هورمون انسولین……….. 54

3-4-4- مطالعه فلورسانس ذاتی هورمون انسولین در حضور آسپیرین…………………….. 55

3-4-5- مطالعه فلورسانس عارضی هورمون انسولین در حضور آسپیرین………………… 56

3-4-6- بررسی تشکیل فیبر آمیلوئیدی هورمون انسولین در حضور

آسپیرین با استفاده از آزمون  فلورسانس تیوفلاوین T (ThT) و آزمون

اسپکتروسکوپی سنجش جذبی کنگورد……………………………………………………………………….. 57

3-4-7- بررسی توده ای شدن پروتئین انسولین استیله و غیر استیله ……………………. 58

3-4-8-  مطالعه اثر استرس های شیمیایی و فیزیکی در القاء تشکیل

فیبر آمیلوئیدی انسولین استیله و غیر استیله…………………………………………………………….. 58

3-4-9- مطالعه جلوگیری از توده ای شدن هورمون انسولین استیله

و غیر استیله با چاپرون های بتا کازئین و آلفا کریستالین……………………………………………. 59

3-4-10- مطالعه ساختار دوم انسولین به روش دو رنگ نمای دورانی

در حضور آسپیرین ………………………………………………………………………………………………………… 59

3-4-11- مطالعه هورمون انسولین به روش دستگاه پراکندگی

پویای نور در حضورآسپیرین……………………………………………………………………………………………. 61

3-4-12- مطالعه تغییرات کشش سطحی نمونه های

انسولین استیله و غیر استیله………………………………………………………………………………………… 62

3-4-13- مشاهده ی فیبر آمیلوئیدی پروتئین با دستگاه

میکروسکوپ فلورسانس…………………………………………………………………………………………………… 63

3-4-14- بررسی فعالیت القا مرگ سلولی انسولین استیله با سنجش MTT …………. 63

3-4-15- آزمون آماری………………………………………………………………………………………………….. 65

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- مطالعه استیلاسیون پروتئین انسولین پانکراس گاوی در حضور آسپیرین……………. 67

4-2- مطالعه بررسی استیلاسیون پروتئین انسولین…………………………………………………………. 67

4-3-  بررسی پیدایش گونه های مولکولی با وزن بالای انسولین در حضور آسپیرین

با الکتروفورز ژلی……………………………………………………………………………………………………………………. 70

4-4- مطالعه پیدایش گونه های مولکولی مختلف انسولین در حضور آسپیرین

با روش پراکنش پویای نور…………………………………………………………………………………………………… 73

4-5- مطالعه ساختار دوم پروتئین انسولین استیله به روش دو رنگ نمای دورانی……….. 75

4-6- مطالعه ساختار سوم انسولین استیله با روش فلورسانس ذاتی و محیطی…………….. 78

4-7- مطالعه کشش سطحی انسولین نمونه های مختلف انسولینی……………………………….. 80

4-8-  بررسی توده ای شدن پروتئین انسولین بعد از فرآیند استیلاسیون…………………….. 82

4-9- بررسی تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین انسولین در حضور آسپیرین

با روش های اسپکتروسکوپی………………………………………………………………………………………………. 84

4-10- مطالعه ی میکروسکوپی تشکیل  فیبر آمیلوئیدی به وسیله ی پروتئین

انسولین در حضور آسپیرین………………………………………………………………………………………………… 87

4-11- مطالعه ی اثر استرس های شیمیایی و فیزیکی بر ساختار و ویژگی های

آمیلوئیدی انسولین استیله و غیر استیله…………………………………………………………………………….. 88

4-12-  مطالعه کینتیک توده ای شدن نمونه های مختلف انسولینی……………………………. 93

4-13- جلوگیری از فرآیند توده ای شدن نمونه های مختلف انسولینی

به کمک دو چاپرون مولکولی آلفا کریستالین و بتا کازئین……………………………………………….. 94

4-14- مطالعه ی سمیت توده های پروتئینی انسولین استیله……………………………………….. 97

 

نتیجه گیری ……………………………………………………………………………………………………………………………… 99

 

فهرست منابع و مآخذ 101

 

فهرست جداول

 

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

جدول3-1- مقادیر لازم برای تهیه ی 1 لیتر بافر فسفات………………………………………………………. 43

جدول3-2- مقادیر لازم برای تهیه ی 1 لیتر بافر تانک………………………………………………………….. 50

جدول 3-3- مقادیر مورد نیاز جهت تهیه ی 25 میلی لیتر بافر نمونه…………………………………. 51

جدول 4-1- تغییرات شعاع هیدرودینامیک پروتئین انسولین در حضور آسپیرین……………… 75

جدول 4-2- محتوای ساختارهای دوم نمونه های مختلف انسولین بر حسب درصد…………… 77

فهرست شکل ها

 

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

شکل 1-1- توالی اسید آمینهی پروتئین انسولین انسانی……………………………………………………….. 4

شکل 1-2- ساختار سوم و چهارم انسولین……………………………………………………………………………….. 7

شکل1-3- نمایی از مراحل سنتز هورمون انسولین………………………………………………………………….. 9

شکل 1-4- نمایی شماتیک از سلول  بتای پانکراس

و چگونگی ترشح انسولین از این سلول…………………………………………………………………………………….. 10

شکل1-5- مدل ساختاری گیرنده انسولین……………………………………………………………………………… 14

شکل1-6- نمایی از ساختار مولکولی داروی آسپیرین……………………………………………………………. 20

شکل1-7- نمایی از مراحل تاخوردگی پروتئین………………………………………………………………………. 23

شکل1-8- نمایی از ایجاد حالات مولکولی گوناگون در مسیر تاخوردگی پروتئین……………….. 25

شکل1-9- تصویر شماتیک الگوی پراش اشعه X  ساختار های بتا در فیبرهای آمیلوئید….. 26

شکل1-10- کینتیک تشکیل فیبر آمیلوئیدی………………………………………………………………………… 27

شکل 1-11- نمایی از ساز و کار فیبریلاسیون هورمون انسولین………………………………………….. 28

شکل1-12- مدل سلسله مراتبی تجمع انسولین در تشکیل فیبر آمیلوئید………………………….. 31

شکل 3-1- نمایی از طیف جذبی انسولین………………………………………………………………………………. 43

شکل3-2-  نمایی از طیف جذبی ANS………………………………………………………………………………….. 44

شکل3-3- نمایی از طیف جذبی تیو فلاوین-T………………………………………………………………………. 45

شکل 3-4- نمایی از طیف جذبی کنگورد……………………………………………………………………………….. 46

شکل3-5-  نمایی از ساختار ترکیبOPA………………………………………………………………………………. 47

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

شکل3-6- نمایی از ساختار شیمیایی ترکیب فلورسامین………………………………………………………. 48

شکل 3-7- دستگاه فلورسانس Cary-Eclips………………………………………………………………………….. 57

شکل 3-8-  نمایی از دستگاه دورنگ نمای دورانی215  Aviv……………………………………………… 60

شکل 3-9- نمایی از دستگاه DLS………………………………………………………………………………………….. 61

شکل3-10- دستگاه کشش سنج Kruss K100…………………………………………………………………….. 62

شکل3-11- نمایی از دستگاه میکروسکوپ فلورسانس Olympus-CX31…………………………… 63

شکل 3-12- نمایی از خانه های پلیت کشت سلولی……………………………………………………………… 64

شکل 3-13- تبدیل  MTTبه فورمازان در یک واکنش کاهشی

در میتوکندری سلول های زنده…………………………………………………………………………………………………. 65

شکل 4-1- نتایج حاصل از مطالعه ی استیلاسیون پروتئین انسولین

با استفاده از آزمون های جذبیOPA و نشری فلورسامین………………………………………………………. 69

شکل 4-2- نمایی از الکتروفورز طبیعی و غیر طبیعی (احیایی و غیر احیایی )

نمونه های مختلف هورمون انسولین………………………………………………………………………………………….. 71

شکل 4-3- نمایی از الکتروفورز طبیعی و غیر طبیعی (احیایی و غیر احیایی )

نمونه های مختلف هورمون انسولین………………………………………………………………………………………… 72

شکل 4-4- مطالعه ی DLS نمونه های متفاوت انسولین……………………………………………………… 74

شکل 4-5- طیف دو رنگ نمای دورانی محدوده فرابنفش دور نمونه های

انسولین استیله شده در مدت زمان 20 روز  و 36 روز………………………………………………………… 76

 

 

شکل 4-6- طیف نشری فلورسانس ذاتی نمونه های مختلف انسولین………………………………….. 79

شکل 4-7- طیف نشری فلورسانس عارضی نمونه های مختلف انسولین……………………………… 80

شکل 4-8- مطالعه ی تغییرات کشش سطحی نمونه های متفاوت انسولین

طی انکوباسیون در مدت زمان 20 و 36 روز…………………………………………………………………………… 82

شکل 4-9- مطالعه ی توده ای شدن انسولین در حضور آسپیری………………………………………… 83

 

عنوان                                                                                                                     صفحه

 

شکل 4-10- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین T نمونه های انکوبه شده

20 روز و 36 روز انسولین در حضور آسپیرین………………………………………………………………………. 85

شکل 4-11- مطالعه ی اتصال کنگورد به نمونه های مختلف انسولینی………………………………. 86

شکل 4-12- تصویر فیبر آمیلوئیدی پروتئین انسولین مشاهده شده

با فلورسانس تیوفلاوین T………………………………………………………………………………………………………….. 88

شکل 4-13- مطالعه ی نشر فلورسانس ذاتی نمونه های متفاوت انسولین

در حضور استرس شیمیایی و فیزیکی…………………………………………………………………………………….. 90

شکل4-14- مطالعه ی نشر فلورسانس عارضی نمونه های متفاوت انسولین

در حضوراسترس شیمیایی و فیزیکی………………………………………………………………………………………. 91

شکل 4-15- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین T نمونه های متفاوت انسولین

در حضور استرس شیمیایی و فیزیکی…………………………………………………………………………………….. 92

شکل 4-16- مطالعه ی کنیتیک توده ای شدن نمونه های مختلف انسولینی……………………. 94

شکل 4-17- مطالعه جلوگیری از فرآیند توده ای شدن نمونه های مختلف

انسولین با استفاده از چاپرون های بتا کازئین و آلفا کریستالین……………………………………………. 96

شکل 4-18- نتایج حاصل از آزمون MTT پس از 24 ساعت انکوبه کردن

رده سلول سرطانی Jurkat با فیبر نمونه های انسولینی استیله وغیراستیله………………………… 98

علائم اختصاری

 

 

BPI: Bovine Pancreatic Insulin.

OPA: o-Phthalaldehyde.

ANS: 1-anilino-8-naphthalene sulfonate.

CD: Circular dichroism.

CDNN: Context dependent neural networks.

DLS: Dynamic light scattering.

DMF: Dimethylformamide.

DMSO: Dimethyl Sulfoxide.

DTT: Dithiothreitol.

MTT:  3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide.

RH: Hydrodynamic radius.

RPMI: Rapid Prototyping & Manufacturing Institute.

SDS: Sodium dodecyl sulfate.

ThT: Thioflavin T.

 

هورمون انسولین

 

مسیر پیچیده کشف انسولین که با یک مشاهده اتفاقی شروع شد، بیانگر موهبتی بزرگ و آزمایش های دقیق است که به وسیله آن بسیاری از هورمون­ها کشف شدند. نقطه آغاز ماجرا اصلا ارتباطی با انسولین نداشت. در سال 1989 اسکار مینکوفسکی[1] به همراه ژوزف فون مرینگ[2] به بررسی دخالت پانکراس سگ در هضم چربی پرداختند. قبل از انجام آزمایش های مربوط به هضم چربی، مینکوفسکی مشاهده کرد که میزان ادرار سگ به طور قابل توجهی افزایش پیدا کرده است و همچنین مقادیر بالایی از گلوکز در ادرار مشاهده می شود. آن­ها با این مشاهده به نقش کمبود عاملی از پانکراس در ایجاد دیابت پی بردند. مینکوفسکی تلاش های زیادی در تهیه عصاره ای از پانکراس کرد تا بتواند اثر دیابت را معکوس نماید ولی هیچ وقت به چنین موفقیتی دست نیافت. امروزه با پیشرفت علم مشخص شده که ماهیت پروتئینی انسولین از یک سو و تولید پروتئازها در پانکراس از سویی دیگر، از طریق تجزیه این هورمون به وسیله این آنزیم ها عامل این شکست بوده است.

تلاش های بی ثمر زیادی در این راستا انجام شد که تا تابستان 1921 نتیجه ای در بر نداشت. در این سال دانشمندی به نام فریدریک بنتینگ[3] با همکاری چارلز بست[4] در آزمایشگاه مک لود[5] این موضوع را بررسی کردند. از این  به بعد بود که سلول های جزایر لانگرهانس به عنوان محل اختصاصی تولید عامل ضد دیابت مشخص شد. بر همین اساس نام انسولین به دلیل اینکه در جزایر لانگرهانس تولید می شود بر روی عامل ضد دیابت گذاشته شد. بنتینگ و بست به همراه بیوشیمی دانی به نام کولیپ[6] موفق به تهیه عصاره ی خالصی از پانکراس شدند که سبب بهبود علایم ناشی از دیابت در سگ شد. یک سال بعد با تزریق فرآورده انسولین به پسر بچه 14 ساله ای به نام لئونارد تامپسون که مبتلا به دیابت قندی شدید بود، جان وی نجات یافت. در سال 1923 جایزه نوبل برای این کشف به بنتینگ و مک لود اهدا شد. تا سال های مدید برای تولید انسولین از پانکراس خوک استفاده می شد تا اینکه در دهه 1980 و با پیشرفت مهندسی ژنتیک از ژن های کلون شده انسانی در میکرو ارگانیسم ها برای این منظور استفاده شد.

انسولین هورمونی است که برای تنظیم ذخیره ی انرژی و سوخت و ساز گلوکز در بدن ضروری است و درون بافت های کبدی، ماهیچه ای و چربی به عنوان یک عامل محرک برای دریافت گلوکز از خون و ذخیره ی آن به صورت گلیکوژن عمل می نماید.

انسولین یکی از کوچکترین پروتئین هایی است که دارای ساختار های متنوع پروتئینی شامل مارپیچ آلفا[7]، صفحات بتا[8]، چرخش بتا[9]، خودتجمعی[10] و فیبرهای آمیلوئیدی[11] است (Hua و همکاران 2004، Dobson 1999 ).

 

1-1- 1- ساختار هورمون انسولین

1-1-1-1- ساختار اول انسولین

انسولین که اولین هورمون پپتیدی  کشف شده می باشد دارای 51 اسید آمینه در دو زنجیره ی پلی پپتیدیA  و B است. ساختار طبیعی این هورمون به وسیله سه پلی دی سولفیدی پایدار می شود. در این پروتئین یک پیوند دی سولفیدی درون زنجیره ای بین اسید آمینه ی سیستئین 6 و 11 زنجیره ی A ، دو پیوند دی سولفیدی بین زنجیره ای میان اسید آمینه های سیستئین موقعیت 7 زنجیره  A و موقعیت 7 زنجیره ی B، همچنین سیستئین جایگاه 20 از زنجیره A و سیستئین جایگاه 19 زنجیره ی B تشکیل می شود. (Nielsen و همکاران 2001)

شکل 1-1- توالی اسید آمینهی پروتئین انسولین انسانی.

 

ساختار اول انسولین در بین گونه های انسانی وحیوانی به صورت حفاظت شده است. جایگاه پیوند های دی سولفیدی و تعداد اسید های آمینه در هر زنجیره در اغلب گونه ها ثابت است. در بین گونه های مختلف، انسولین های انسانی، گاوی و خوکی دارای بیشترین شباهت هستند. درمقایسه با انسولین انسانی در گونه ی خوکی درموقعیت 30 زنجیره B اسید آمینه آلانین جایگزین اسید آمینه ترئونین شده است و در انسولین گاوی علاوه بر این تغییر در موقعیت A8 آلانین جانشین ترئونین و در موقعیت A10 والین جایگزین ایزولوسین گردیده است. این تغییرات تاثیری بر روی فعالیت زیستی این هورمون ندارد. دیگر اسید های آمینه که بدون تغییر در بین گونه ها باقی مانده اند مسئول شکل گیری ساختار مولکول بوده و به تا خوردگی صحیح مولکول انسولین کمک می کنند. به عنوان مثل باقی مانده های اسید آمینه ی سیستئین، اسید آمینه های غیر قطبی که هسته آبگریز پروتئین را تشکیل می دهند و سایر باقی مانده های اسید آمینه ای که در تا خوردگی صحیح ساختار سوم این پروتئین نقش ایفا می کنند در پدیده های فوق الذکر اهمیت دارند (Brange و همکاران 1993).